品牌时光机-品牌案例《Science | HIV疫苗取得阶段性研究进展》

摘要：发现基于mRNA-LNP平台对免疫原进行包装提高了潜在的HIV疫苗开发的有效性。

人类与人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）抗争了近半个世纪，至今尚没有一款有效的HIV疫苗问世。据世界卫生组织估计，截止2022年，约有3900万人携带HIV生存。绝大多数患者一经携带病毒，需要终生服用抗逆转录病毒药物（Antiretroviral therapy，ART)，毒副作用难以避免，这不仅降低病人的生存质量，而且造成很大的经济负担，因此开发一款有效的HIV疫苗迫在眉睫。

然而相比较严重的呼吸道冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV2)，HIV有更多的变异株，更强的遗传物质突变率和免疫逃逸能力，并且病毒的包膜（Envelope，ENV）蛋白包含了丰富复杂的多糖（glycan）修饰，导致其免疫原性很低，给疫苗研发带来了巨大的挑战。

广谱性中和抗体（broadly neutralization antibodies，bNAbs）是一类能特异性识别病毒，并且能阻断病毒复制，扩增或者传播的抗体，由一群特殊的白细胞—B淋巴细胞产生，也是众多疫苗接种后能够发挥其功效的主要效应物。在HIV慢性感染的病人中，分离出的bNAbs主要靶向HIV ENV 的几个保守的表位（epitope），然而这些诱导产生的bNAbs大多都是病人体内的B细胞和HIV长期共同进化的结果。相比较能产生bNAbs最初的前体（precursor）B细胞，这些成熟的B细胞编码bNAb的DNA序列发生了极高的体细胞高频突变（somatic hypermutation，SHM），其编码的总的氨基酸突变率往往超过30%，大大高于产生的针对于流感和新冠的bNAb的成熟的B细胞（一般小于10%）；并且这些前体B细胞在人的整个B细胞库中占比很低。更让人沮丧的是，这些能产生针对HIV bNAb的绝大多数前体B细胞，其表面的B细胞受体（B cell receptor，BCR，与分泌的抗体序列一致）并不能识别原始的ENV蛋白（native ENV），若是直接将这些原始的ENV蛋白去接种人群，并不能激活这些bNAb前体细胞，直接导致疫苗失效。

2024年5月17 日，美国Harvard, MIT和麻省总院附属下的Ragon研究所的Facundo D. Batista 团队联合Scripps 研究所William R. Schief 和Andrew B. Ward 团队在Science上以长文的形式在线发表了题为mRNA-LNP HIV-1 trimer boosters elicit precursors to broad neutralizing antibodies 的研究，为种系细胞靶向激活（germline targeting，GT）和递进式免疫策略在HIV疫苗开发上的可行性提供了证据，同时文章发现基于mRNA-LNP平台对免疫原进行包装提高了潜在的HIV疫苗开发的有效性。

由于不同物种的BCR序列库差异巨大，这种差异又导致了不同物种对同一款疫苗的不同响应，这种效应在HIV疫苗开发上尤为显著。为了确保所开发的疫苗和免疫流程在将来人的临床试验中有效，来自Ragon Batista实验室的研究人员通过CRIPSR-Cas9技术将表达人的抗HIV bNAb的前体细胞的重链区，BCR成分之一的DNA序列敲入到小鼠的BCR基因编码区，使其“人源化”。这种“人源化”小鼠B细胞能够提呈人的BCR到细胞膜表面，以期能够更好的评估疫苗将来在人类临床上的有效性。为了有效激活抗HIV bNAb的前体细胞并且指导他们向正确的路径进行进化成熟，研究人员基于种系细胞靶向激活（germline targeting，GT）和递进式免疫（sequential immunization）的理念，在深入洞悉了成熟bNAb与原始ENV结合的结构基础上，综合大规模体外筛选开发了GT 免疫原和一系列渐变类似原始ENV的加强（boost）免疫原。

在这篇文章中，来自Scripps Schief团队的研究人员使用了针对ENV V3-glycan表位的bNAb——BG18的前体BCR序列（BG18^gH）作为研究模型，开发了针对该表位的GT 免疫原N332-GT5。为了更好的模拟人的生理状况，研究人员将表达BG18^gH的B细胞（C57BL/6J 背景, CD45.2⁺）通过静脉注射移植到同类系（congenic）的小鼠（CD45.1⁺）上，稀释这群前体细胞，以模拟其在人体内的低频率。通过抗CD45.2 和抗CD45.1的流式抗体染色，即可以追踪对疫苗产生响应的细胞来源。首先研究人员将移植了CD45.2⁺ BG18^gH的CD45.1⁺ 受体小鼠进行了GT免疫原N332-GT5和原始样ENV免疫原BG505-MD39三体蛋白免疫，发现N332-GT5三体蛋白免疫后，大量的CD45.2⁺ BG18^gH B细胞被招募到生发中心（Germinal Center, GC），提示这些bNAb前体细胞发生了特异性的激活；然而免疫BG505-MD39三体蛋白后，这些前体细胞无响应，进一步验证了设计GT免疫原的重要性。紧接着，研究人员追踪了这群前体B细胞在N332-GT5三体蛋白免疫后的动态变化，发现这群前体细胞能够强烈活化，在GC驻留长达49天，并且这群细胞能特异性结合N332-GT5的V3-glycan表位。

前体B细胞在GC会发生一系列剧烈的变化，其编码的BCR序列会在激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（Activation-induced cytidine deaminase，AID）的作用下进行高频突变，同时也伴随着BCR恒定区的类别转换（class switch），他们竞争有限的抗原和T细胞的帮助，这个过程遵循着达尔文的“优胜劣汰”进化法则，其最终的结果是进化后的一部分B细胞拥有了对于免疫原的高亲和力（affinity），同时这些前体B细胞会进一步分化出记忆B细胞（memory B）和浆细胞（plasma cell），而浆细胞能够将在细胞膜上锚定的BCR以分泌态形式递送到胞外至血浆，这就是抗体。研究人员发现相较于野生型（wide type，WT）CD45.1小鼠，移植了BG18^gH细胞的CD45.1受体小鼠血浆在N332-GT5免疫后产生了更多的针对V3-glycan表位的抗体，之后通过负染电镜多克隆表位定位（negative-stain electron microscopy polyclonal epitope mapping，nsEMPEM）技术，结合冷冻电镜（cryo-electron microscopy）技术，对小鼠血浆进行了cryoEMPEM检测，高分辨率结构显示BG18^gH分泌的抗体能够真正结合V3-glycan表位，而WT小鼠产生的抗体实际上结合的是靠近V3-glycan表位的V1环（V1 loop），而这是偏离了靶向V3-glycan bNAb的成熟路径的，这也进一步证实使用BCR人源化小鼠模型进行HIV疫苗研究的重要性。为了追踪N332-GT5免疫原能否诱导前体B细胞亲和力成熟，研究人员通过流式分选收集了这群CD45.2⁺能特异性结合抗原的细胞，并对BCR的序列进行测序分析。结果表明这些BCR序列随着疫苗接种时间的延长突变率逐步增加，这些突变在抗原决定簇（complementarity- determining regions, CDRs）富集。同时相较于原始BG18^gH 细胞，在GC中进化了42天的BG18^gH细胞对于N332-GT5抗原的亲和力提高了几十倍。

在GT和递进式免疫的框架下，诱导bNAb前体细胞活化是非常重要的第一步，接下来，研究人员想探究这群激活的前体细胞是否能被加强免疫原（booster）进一步诱导成熟。已有研究发现在许多加强免疫的模型中，被booster激活进入GC的大部分是新生的前体B细胞，即使一些之前被初次免疫（prime）激活诱导产生的记忆B细胞能够被再度活化，这种被召唤的记忆B细胞大多能很快分化出浆细胞分泌抗体，但是他们似乎不太容易再次进入GC进行新一轮的迭代进化，这会给后续HIV bNAb前体细胞的持续成熟带来很大的困难。为了探究那些原先被激活的前体细胞能否进一步被诱导成熟，接下来研究人员设计了booster B11 和 B16。相比较N332-GT5 初次免疫原，这些boosters在V3-glycan表位有更少的人为突变，并且在N133 或者N137位点引入了glycan修饰，因此他们更接近原始ENV免疫原。接着研究人员将移植了CD45.2⁺ BG18^gH的CD45.1⁺受体小鼠进行N332-GT5蛋白初次免疫，然后进行B11或者B16蛋白的加强免疫，于第65天进行流式检测。相比较只进行N332-GT5初次免疫，进行booster免疫后，研究人员能发现相对更多的CD45.2⁺ BG18^gH细胞在GC里面被持续活化，他们的突变率持续增长，并且加强免疫后，这些BG18^gH细胞对于booster的亲和力也是增加的。之后结构生物学手段显示一些通过BG18^gH BCR突变序列（第 77天）衍生的抗体与booster B11和B16结合模式类似于成熟的BG18抗体结合原始样ENV蛋白BG505-MD39，提示这些加强免疫原能够进一步诱导BG18 bNAb前体细胞在正确的路径上持续成熟。

mRNA-LNP疫苗在SARS-CoV2大流行期间展现了非常好的效果，为新生代疫苗研发提供了一个强有力的手段。为了探究基于mRNA-LNP平台设计的N332-GT5免疫原是否同样有效，研究人员使用了BG18^gH的小鼠模型检测了由Moderna制备的N332-GT5 mRNA-LNP的免疫原性，发现类似于N332-GT5 蛋白，mRNA免疫原同样能高效激活BG18^gH 细胞，指导他们的BCR进化和亲和力成熟，显示N332-GT5 mRNA能够复刻其蛋白的免疫原性。紧接着研究人员探究了同样制备成mRNA-LNP形式B11和B16免疫原，并对BG18^gH细胞移植模型进行了mRNA免疫原prime-boost的免疫流程，发现大量的BG18^gH细胞能够在GC里面持续驻留可长达78天。与蛋白加强免疫原类似，B11和B16 mRNA boosters能够持续增加BG18^gH细胞的BCR突变率，提高他们对加强免疫原的亲和力，甚至比对应的蛋白booster更高。最后研究人员表达了一些基于BG18^gH突变的BCR序列（第78天）衍生的抗体进行了体外假病毒中和能力（neutralization）检测，发现他们已经能有效中和一些中间型类原始病毒，但是与成熟的BG18 bNAb相比，他们并不能中和完全原始型毒株，提示这些BG18前体细胞尚需更多的中间型boosters进一步诱导直至完全成熟。

总之这篇研究进一步为GT 和递进式免疫策略在HIV疫苗开发上的可行性提供了证据，同时文章发现基于mRNA-LNP平台对免疫原进行包装提高了潜在的HIV疫苗开发的有效性。另外文章中指出的这种在连续免疫路径中作用的靶细胞是传统意义上大家所认为的通过迭代召回GC进行成熟的记忆B细胞，还是一直在GC中驻留的前体B细胞，或将引发领域内对于B 细胞基本生物学特性的进一步思考。同时另一篇背靠背文章【1】表明N332-GT5蛋白免疫原在恒河猴（rhesus macaques）中能同样高效激活类似BG18的bNAb前体细胞。此外，在Science Immunology【2】和Science Translational Medicine【3】同时上线的文章报道了依托mRNA-LNP 递送系统，设计的疫苗对ENV 另一个表位CD4 binding site（CD4bs）同样有效。

为了更有效传递本研究的核心发现，艺术家协助设计了一幅插画来表达这项研究所披露的主要信息，插画设计灵感来源于传统装饰图案——双龙戏珠。龙身中有很多mRNA碱基进行局部自身配对形成的环装结构代表N332-GT5，B11和B16 mRNA-LNP免疫原；凤凰的身体由类似ENV蛋白三聚体组成，代表mRNA对应的蛋白质免疫原；珍珠代表bNAb 前体细胞。龙和凤凰迸射出火焰煅烧这枚珍珠，寓意免疫原在指导HIV bNAb前体细胞进化成熟；同时在传统意义上，龙被认为比凤凰有更强的力量，寓意mRNA-LNP的迭代免疫途径的效果会比蛋白免疫更好。