不会分析IHC实验问题？我教你啊！玩转IHC实验-下篇

IHC-P实验流程

小编分析发现，师妹的实验操作和试剂都没问题，查文献发现Ki67蛋白是一个很有特点的蛋白，主要在增殖细胞表达(蛋白水平)；通常在细胞分裂的G1晚期、S期、G2期和M期表达，而在G0期不能检测到Ki67蛋白。师妹用的组织是肾脏组织，处于有丝分裂时期的细胞数目非常非常的少，所以如果不多观察一些视野或者组织不同位置的切片，可能就是无信号的结果。小编还给师妹找到了abcam产品检测Ki67在小鼠肾脏组织中的图片（图3）。最终师妹通过多观察一些视野，终于找到了阳性信号。

小师妹的这个例子是典型靶标蛋白特性导致IHC实验无信号，除靶标蛋白特性原因外，样本固定、脱蜡、抗体孵育和检测等实验操作过程操作不当或使用试剂不合适，都有可能导致无信号的发生，具体原因及优化方案如下（表1）：

高背景的问题也是IHC实验时经常会出现的，导致高背景的原因也是多种多样，总结分析来看，试剂的选择和使用是最关键的，例如检测体系的影响，选择HRP偶联的二抗检测时，需要封闭组织切片中的内源过氧化物酶；选择荧光偶联的二抗检测时，如果组织固定时选择的是醛类试剂，由于自由醛基会引起自发荧光，所以可以选择在封闭液中使用0.3M甘氨酸来淬灭自发荧光，或者选择偶联红色光谱范围内的荧光基团的二抗等。除了我们列举的几个例子，还有很多原因，例如样本固定、封闭、抗体孵育和检测等过程使用的试剂不合适或操作不当，也会导致高背景的发生，详细的原因和优化方案如下（表2）：

组织离体后进入固定液之间的时间称为冷缺血时间，冷缺血的时间通常建议不要超过1个小时，不然组织可能会发生自溶，导致非特异性的染色。除此以外，IHC实验中切片、脱蜡、通透、封闭和抗体孵育等过程试剂或操作不当，也有可能导致非特异性染色。具体的原因和优化方案如下（表3）：

组织切片形态清晰完整是分析实验结果的前提，IHC实验有时可能会出现组织形态不清晰或受损的情况，主要可能由固定、切片以及抗原修复过程中不合适的操作导致。详细的原因和优化方案如下（表4）：