谣言粉碎机 | 别再用-20℃冰箱里保存样本了，这些蛋白降解了你都不知道！【靶点解惑】

//话不多说，直接展示Abcam内部实验室结果！谣言终结者，有图有真相！

通常情况下，WB无信号的原因是复杂的，需要仔细对比实验流程中的每一个步骤，才有可能找到问题的关键。其中，蛋白是否被成功的提取和保存，是一个需要重点考虑的因素。

在细胞破裂蛋白抽提的过程中，蛋白酶也会被一起释放出来，混入蛋白样品中的蛋白酶会作用于样本中的靶标蛋白，导致原本已经提取出来的蛋白被降解掉，最终检测时可能会出现目的条带会变弱的情况，严重时还会无信号。

通常情况下，建议样本制备过程全程置于冰上或4℃环境下，同时在裂解液中添加蛋白酶抑制剂（现用现配）以防止蛋白降解。同时，不同细胞一般会含有多种不同种类的蛋白酶，为了更好的抑制蛋白降解，建议选择复合蛋白酶抑制剂。以下为部分复合蛋白酶抑制剂的名称、关键信息、抑制剂组成及靶向蛋白酶的详细信息：

然而，有时也会发现，就算已经按照上述要求做了，并且将样本分装好保存在-20℃冰箱内，可再次使用时也还是会检测不到目的条带，这是为什么呢？

这种通用protocol无法解决的情况，则需要考虑是否是靶标特性引起的。

以下3个例子，教你如何快速识别靶标蛋白特性，get样本处理新技能，解决因降解导致的WB无信号烦恼！

eNOS是一个特别典型的，需要现用现制备裂解液的靶标蛋白，主要是因为eNOS蛋白在裂解液中储存时极易发生降解。所以，为了避免蛋白降解后导致检测信号减弱，请使用新鲜制备的全细胞裂解液，并立即用于WB检测。

eNOS蛋白预测大小为133 kDa，同时存在约60 kDa的剪切体形式，在WB检测时可能会观察到多条条带现象。对于分子量大于100 kDa的蛋白，建议选择适用于大分子量蛋白检测的实验条件，例如，在WB实验中使用较低浓度的分离胶（如6~8%）进行电泳；转膜时，建议使用0.45μm的PVDF膜，转膜缓冲液中的甲醇含量可选择10%或更低浓度，同时加入SDS至终浓度为0.1%。

刺激诱导对于部分细胞系中eNOS及其磷酸化蛋白的检测是必要的。例如：部分细胞系在经过药物刺激处理之后更易检测到eNOS蛋白（eg：10 µg/ml LPS刺激处理HepG2细胞2小时）；部分细胞系在经过药物刺激处理之后更易检测到eNOS（phospho S1177）蛋白（eg：pervanadate或VEGF刺激处理的HUVEC细胞；PMA刺激处理的THP1细胞）；在检测磷酸化eNOS蛋白时，可设置phosphatase去磷酸化的处理组，以判别磷酸化信号特异性。

在正常情况下，Nrf2会被泛素化修饰并在细胞质中降解导致在WB中难以检测。MG132是一种蛋白酶体抑制剂，在细胞中加入MG132能有效抑制该降解过程，增加Nrf2的检测信号，例如：2 µM MG-132处理18小时的Hela或HepG2，25 µM MG-132处理4小时的HCT 116，建议查阅文献或产品说明书选择最合适的处理条件。

氧化应激反应，亲电试剂，化学激活剂和自噬会导致NFE2L2/NRF2在细胞核内聚集，例如：30 µM tBHQ处理4小时的MDA-MB-231，所以适当的样本刺激处理对于WB实验的成功至关重要。

Nrf2预测分子量68 kDa，但由于存在异构体及翻译后修饰，WB实验中可能观察到多条条带的情况，同时，实际检测到的分子量大于100 kDa，与预测分子量存在区别，建议不要裁膜。建议选择适用于大分子量蛋白检测的实验条件，例如，在WB实验中使用较低浓度的分离胶（如6~8%）进行电泳；转膜时，建议使用0.45μm的PVDF膜，转膜缓冲液中的甲醇含量可选择10%或更低浓度，同时加入SDS至终浓度为0.1%。

Collagen蛋白家族由 28 个成员组成（I-XXVIII），最常见形式为I型、II型、III型、IV型和V型。👉🏻点击此处，查看更多关于Collagen蛋白家族的介绍。

小编以Collagen I、Collagen III为例，介绍WB操作中需要特别注意的实验关键点：

在检测时Collagen I可能会观察到多条条带现象，如图3中220 kDa 的collagen I 前体蛋白，60-75 kDa 的剪切片段，35 kDa 的C-前肽剪切体，请注意在检测不同类型样本或使用不同抗体时，这些观察到的条带可能会存在区别。Collagen I 存在表达特异性，在心脏、肾脏、肺组织中的检测信号相对较弱（如图4），若不确定样本中靶标蛋白的表达水平，建议选择皮肤组织作为阳性对照。同时，可通过优化实验条件，例如提高抗体使用浓度、增加上样量、延长曝光时间等方法增强检测信号。Collagen I本身在样本中存在很多的剪切位点，所以如果样本处理不当，很容易发生降解或是剪切，因此建议使用新鲜培养收集的细胞制备样本，同时提高裂解液中蛋白酶抑制剂的浓度，最大程度避免蛋白发生降解。由于一些抗体产品（例如👉🏻ab260043）的免疫原为重组片段,同时包含糖基化修饰位点，因此可能会存在多条条带现象。以及一些其他实验条件优化：电泳时向样品中加入洗涤剂、还原剂和离液剂。Collagen I可使用 6% 的丙烯酰胺凝胶。向样品中添加4M尿素可改善电泳过程中胶原蛋白的分离。推荐使用天然蛋白质标准品作为阳性和阴性对照。   

Collagen III作为一种胞外基质蛋白，通常是一些中空器官，例如血管、子宫、肠道的主要构成部分，赋予组织能够承受一定程度的拉伸。WB检测时若不确定样本中靶标蛋白的表达水平，建议选择皮肤组织作为阳性对照（图5）。同时，可通过优化实验条件，例如增加蛋白上样量、使用新鲜制备的裂解液、提高抗体使用浓度、延长曝光时间（图6）等方法增强检测信号。同样类型的样本，例如正常的皮肤、成纤维细胞，胎儿时期Collagen III的含量和比例会高于成人时期（PMID: 19685484，29316315），因此选择发育早期或幼龄阶段的样本通常更容易检测到Collagen III。如果涉及病理样本中Collagen III的检测，需要注意Collagen III的表达会在伤口形成早期、慢性炎症阶段上调，随着伤口愈合、胞外基质重建完成逐渐降低（PMID: 36776717），不同病理阶段的样本中Collagen III的表达情况可能存在差异。

由于胶原蛋白比其他蛋白质更不稳定，检测应在 4℃/冰上进行。同时，为防止胶原蛋白聚集，请注意实验试剂pH值、温度以及胶原蛋白浓度。胶原蛋白易溶于酸性溶液，所以酸性环境（例如，0.5M 醋酸，在 pH 2.5 下保持 24 小时）对胶原蛋白稳定性及可溶性非常重要。在碱性 pH 下，胶原蛋白会聚合形成凝胶。如果所用的胶原蛋白浓度太高，也会导致凝胶的形成。